adam strus endokrynolog

Pogrubiona czarna linia w każdej rodzinie śladów reprezentuje prąd końcowy zarejestrowany po 1,4-sekundowym prepulse na 0 mV. W dzikich komórach ekspresjonujących cClC-1 (3 (Figura 4c), kanały są w pełni aktywowane przy tym potencjale, podczas gdy bardzo mała aktywacja kanału (<13%) zachodzi w komórkach wyrażających T268M (Figura 4d). Na Figurze 4, e i f, bieżące ślady uzyskane z dwóch komórek wyrażających rybozym ilustrują widmo biofizycznego ratowania za pomocą kompletnej (Figura 4e) lub częściowej (około 40% aktywacji, Figura 4f) przywrócenia funkcji kanału chlorkowego typu dzikiego. Oceniliśmy stopień odtworzenia funkcjonalnego w kilku pojedynczych komórkach, badając zależność napięcia od aktywacji i określając napięcie, przy którym występuje połowa maksymalnej aktywacji (V1 / 2) (Figura 5). Skategoryzowaliśmy wielkość naprawy jako pełną, częściową lub żadną w oparciu o obserwowane zmiany w V1 / 2 (Figura 5a). Pełną naprawę zdefiniowano jako V1 / 2 mieszczącą się w zakresie 5 mV cClC-1 typu dzikiego, wartość dobrze w obrębie jednego SD średniej. Żadna naprawa nie została zdefiniowana jako wartości V1 / 2 mieszczące się w granicach dwóch SD (około 18 mV) średniej T268M. Pozostałe wartości uznano za wskazujące na częściową naprawę (tj. Mieszaną populację zmutowanych i skorygowanych kanałów). Trzynaście z 71 transfekowanych komórek rybozymu (18%) wykazywało znaczące przesunięcie V1 / 2 do bardziej ujemnych potencjałów. Dwie z tych komórek wykazały całkowite przesunięcie krzywej aktywacji do napięć, które nie różnią się znacząco od cClC-1 typu dzikiego, co sugeruje, że rybozym z poprzecznym splicingiem ma zdolność do całkowitego uratowania zmutowanego fenotypu. Figura 5b ilustruje aktywację V1 / 2 dla cClC-1 typu dzikiego (kwadrat) i T268M (diament). Wartości V1 / 2 z 13 komórek transfekowanych rybozymem, które wykazywały pewien stopień korekcji biofizycznej, pokazano indywidualnie (wypełnione kółka), podczas gdy średnia V1 / 2 nierepre-sowanych komórek jest pokazana jako pojedynczy punkt danych (otwarty okrąg). Komórki stabilne wobec T268M transfekowane nieaktywnym rybozymem nie wykazują znaczącej zmiany aktywacji (trójkąt). Dane te wskazują, że rybozym z poprzecznym splicingiem jest zdolny do przywracania funkcji typu dzikiego zmutowanemu kanałowi chlorku mięśnia szkieletowego, ale istnieje znaczna zmienność pomiędzy komórkami w wydajności reakcji. Figura 5Spektrum przywrócenia funkcji cClC-1 za pośrednictwem rybozymu. (a) Zależność napięcia od aktywacji cClC-1 typu dzikiego (kwadraty), T268M (romby) i trzech reprezentatywnych komórek T268M transfekowanych rybozymem (czarne linie). Kropkowane krzywe reprezentują dwa SD od średniej T268M. (b) Schemat rozproszenia ilustrujący V1 / 2 określony dla komórek wyrażających dzikiego typu cClC-1, T268M i T268M traktowany rybozymem. Dane dla 13 komórek wykazujących znaczny poziom naprawy funkcjonalnej są przedstawione jako pojedyncze punkty danych (wypełnione kółka). Wartości średnie dla cClC-1 typu dzikiego (kwadrat, n = 12), nietraktowanego T268M (diament, n = 52), T268M traktowanego rybozymem bez naprawy (otwarty okrąg, n = 58) i nieaktywnego traktowanego rybozymem T268M (trójkąt , n = 11) są pokazane jako pojedyncze punkty. Kropkowana linia reprezentuje dwa SDs od średniej T268M. Paski błędów przedstawiają SEM. (W niektórych przypadkach symbole danych są większe niż paski błędów.) Dyskusja W tym artykule opisujemy inżynierię rybozymu z poprzecznym łączeniem, aby skorygować zmutowany mRNA kanału chlorku mięśnia szkieletowego. Rybozym zastosowano do naprawy transkryptów T268M w ssaczej linii komórkowej przez trans-splicing 3-kb wypełniacza regeneracyjnego 3. ekson. Analiza sekwencji wskazała, że była to reakcja o wysokiej wierności. Skuteczność naprawy RNA za pośrednictwem rybozymów określona w populacji komórek nie była wysoka (1,2%). Jednak stosując metody elektrofizjologiczne jednokomórkowe, wykazaliśmy szereg istotnych przywracających funkcjonalność, z niektórymi komórkami wykazującymi całkowite wyleczenie wady kanału chlorkowego.
[więcej w: kalprotektyna, olx międzyrzec podlaski, kłykciny kończyste objawy ]