augustyn warszawa

Spośród poszczególnych analizowanych komórek, 18% (13/71) wykazywało znaczącą biofizyczną poprawę aktywności kanału, z właściwościami funkcjonalnymi typu dzikiego przywróconymi w kilku komórkach. Dane te stanowią pierwszą bezpośrednią demonstrację pełnego przywrócenia funkcji białka przy użyciu rybozymów trans-splicingowych. Skuteczność reakcji trans-splicingu jest kluczową kwestią. Nasze wyniki sugerują, że skuteczność reakcji mierzona w populacji komórek jest niska, ale nie odzwierciedla ściśle poziomu naprawy w poszczególnych komórkach. Możemy spekulować na temat różnych wyjaśnień tego zjawiska. Rozmiar 3. Ekson używany przez nasz rybozym nie jest prawdopodobnie czynnikiem, ponieważ zaobserwowaliśmy podobne poziomy wydajności naprawy z konstruktami mającymi mniejsze eksony (CS Rogers, wyniki niepublikowane). Dostarczanie i ekspresja zmiennego rybozymu jest najprostszym wytłumaczeniem szerokiego zakresu aktywności obserwowanej na poziomie pojedynczej komórki. Monitorowaliśmy skuteczność transfekcji przez koekspresję EGFP z tego samego plazmidu i próbowaliśmy odpowiednio poprawić wartości skuteczności naprawy RNA. Jednak wymagania komórkowe do ekspresji EGFP i aktywnego katalitycznie rybozymu mogą być znacznie różne. Ponadto osiągnięcie wysoce wydajnego trans-splicingu może wymagać dużego molowego nadmiaru rybozymu daleko poza 7,6-krotny stosunek rybozymu do T268M zmierzony w naszym układzie in vitro (stabilna linia komórkowa z nadekspresją docelowego RNA). Innym wyjaśnieniem może być zmienna skuteczność naprawy na poziomie molekularnym z powodu zmiennego zwijania RNA i interakcji z białkami wiążącymi RNA, które zmieniają dostępność miejsca (18). Pomysł ten jest potwierdzony przez wykazane znaczenie mapowania docelowego RNA dla dostępnych miejsc dla pomyślnego zaprojektowania rybozymów z młotkiem i trans-splicingu (9, 19). Dodatkowo, Lan i in. wykazali, że dwa rybozymy trans-splicingowe skierowane do różnych regionów tego samego docelowego RNA dały wyższą skuteczność naprawy RNA, gdy są stosowane razem niż sam ryozyme, prawdopodobnie z powodu zmiennej dostępności poszczególnych miejsc na docelowym RNA (20). Odpowiednio, traktowanie komórek pulą rybozymów wielu IGS może być sposobem na obejście zmiennej aktywności rybozymu. Badania nad rybozymem z młotkiem wykazały korzyści z kolokalizacji rybozymów i docelowych transkryptów RNA, aby zapewnić skuteczne cięcie substratu (21, 22). Wyrażenie identycznych sygnałów lokalizacyjnych w obrębie 3. Wykazano, że UTR każdego transkryptu kolokalizuje RNA i poprawia wydajność reakcji w porównaniu z niezlokalizowanymi RNA (23). Ta strategia nie została jeszcze zbadana dla rybozymu trans-splicingu. Ponadto obecnie nie wiadomo, czy mRNA cClC-1 jest specyficznie zlokalizowany w komórce. Nie zaobserwowaliśmy żadnej różnicy w wydajności naprawy RNA między rybozymami posiadającymi kompletny lub skrócony cClC-1 3. UTRs. Dlatego jeśli 3. UTR zawiera sygnały lokalizacyjne, jego włączenie nie miało wpływu na efektywność łączenia. Bardziej zrozumienie zmienności między komórkami w aktywności rybozymu można uzyskać, jeśli skuteczność naprawy pojedynczego RNA można skorelować z danymi dotyczącymi aktywności pojedynczej komórki, tak jak w naszym systemie eksperymentalnym. Możemy również spekulować, że heterogeniczność na etapie cyklu komórkowego może wpływać na wydajność trans-splicingu, prawdopodobnie przez wpływ na czasowy związek rybozymu i docelowej ekspresji mRNA (24, 25). Nasza praca pokazuje również, że intronowy ryozym Tetrahymena grupy I może z powodzeniem trans-spliczyć duży ekson (4 kb). Większość wcześniej opisanych eksperymentów naprawy RNA wykazała trans-splicing krótkich 3. eksonów (<1 kb) i nie zajęły się nośnością tych cząsteczek, potencjalnym ograniczeniem strategii naprawy RNA [patrz też: jęczmień zielony opinie, jaskolcze ziele, kalorie banan ]