dolmed cennik badań

Zakreślony region jest rozszerzany w celu pokazania interakcji IGS, helisy P10 i interakcji z antysensownym regionem. Podkreślone zasady wskazują znacznik sekwencji cichych mutacji. Poprzednie doniesienia sugerowały, że rybozym zawierający sześć nukleotydów nie wykazuje aktywności po ekspresji z jądra w komórkach ssaków (BA Sullenger, wyniki niepublikowane). Dlatego, do stosowania w komórkach zaprojektowano rybozym (oznaczony RzU712AS) skierowany na U712 z modyfikacjami, które, jak wykazano, zwiększają aktywność, w tym IGS o dziewięciu nukleotydach, helisę P10 i antysensowny region 33-nukleotydowy (Figura 1) (11, 14). Ponieważ region antysensowny celuje w sekwencję RNA identyczną z analogiczną sekwencją w 3. eksonu rybozymu, ciche mutacje zostały wprowadzone do 3. eksonu, aby zapobiec inaktywacji rybozymu przez parowanie wewnątrzcząsteczkowe. Ta modyfikacja służyła również jako znacznik sekwencji do rozróżniania produktów splicingowanych trans z niesklasyfikowanych RNA w kolejnych testach opartych na hybrydyzacji. Naprawa in vitro mRNA T268M. Zdolność rybozymu do wykonywania trans-splicingu badano w komórkach HEK-293 trwale eksprymujących T268M (komórki stabilne wobec T268M). Ta ludzka zarodkowa linia komórek nerkowych nie eksprymuje endogennego ClC-1 (15). Komórki transfekowano plazmidowym DNA kodującym rybozym, a całkowity RNA wyizolowano 20 godzin później. Test RT-PCR specyficzny dla allelu potwierdził trans-splicing w komórkach transfekowanych rybozymem, podczas gdy komórki transfekowane katalitycznie nieaktywnym rybozymem nie wykazywały produktów reakcji trans-splicingu (Figura 2a). Aby wykazać, że reakcja naprawy RNA wystąpiła w komórkach traktowanych rybozymem, a nie podczas procedury izolacji RNA, komórki HEK-293 transfekowane rybozymem zostały zmieszane z komórkami stabilnymi T268M przed izolacją RNA. W tym eksperymencie nie zaobserwowano produktu trans-splicingu (Figura 2a). Planowane skrzyżowanie trans-splicingowe zostało potwierdzone przez analizę sekwencji DNA produktów RT-PCR z stabilnych komórek T268M transfekowanych rybozymem (Figura 2b), co wskazuje na wierność reakcji. Rysunek 2 Naprawa in vitro T268M. (a) amplifikacja specyficznego dla allelu RT-PCR produktu złożonego w transkryptach 358 pz z komórek traktowanych rybozymem. Nieaktywne komórki T268M stabilne wobec rybozymu, nietransfekowane komórki stabilne wobec T268M i mieszanka komórek HEK-293 traktowanych rybozymem i komórek stabilnych wobec T268M nie dały produktu. (b) Reprezentatywny ślad sekwencji naprawionej sekwencji cClC-1. Docelowy urydynę (T / U712) i połączenie tran-splicingowe są oznaczone. Podkreślone zasady oznaczają znacznik sekwencji. Skuteczność reakcji trans-splicingu. Skuteczność naprawy mRNA oceniano za pomocą ilościowego RT-PCR w czasie rzeczywistym z zastosowaniem chemii TaqMan. W przypadku tych eksperymentów efektywność zdefiniowano jako odsetek całkowitych docelowych RNA, które były prawidłowo trans-splicowane. Zestaw starterów zaprojektowano do specyficznego wzmacniania produktów trans-splicingowych i niereprodukowanych w oddzielnych reakcjach, podczas gdy fluorogenna sonda oligonukleotydowa została użyta do wykrywania produktów splicingowanych lub niesklejonych. Test wydajności naprawy RNA został zwalidowany przy użyciu różnych stosunków zmutowanych i plazmidowego DNA typu dzikiego, aby reprezentować różne poziomy wydajności naprawy. Oczekiwane i rzeczywiste wartości zostały skorelowane liniowo (R2 = 0,999). Skuteczność reakcji trans-splicingu została określona przy użyciu całkowitego RNA wyizolowanego z stabilnych komórek T268M transfekowanych plazmidami kodującymi aktywny lub nieaktywny rybozym. Aby umożliwić wizualizację i kwantyfikację transfekowanych komórek, skonstruowaliśmy konstrukty rybozymów w bicistronowym plazmidzie, który steruje ekspresją EGFP i rybozymu z oddzielnych promotorów. Aby ułatwić budowę tych plazmidów, 3. region nieulegający translacji (UTR) cClC-1 został częściowo skrócony, pozostawiając 3,2 kb 3. ekson
[przypisy: jaskolcze ziele, kłykciny kończyste objawy, kardiowersja elektryczna ]