dreszcze u dziecka przy gorączce

Ponieważ transfekcja zachodzi ze zmienną wydajnością, skorygowaliśmy zmierzony poziom niepodzielonego produktu w każdym eksperymencie, stosując podejście opisane w Methods. Komórki transfekowane rybozymem wykazywały skuteczność naprawy RNA 1,2%. 0,1% (n = 16), podczas gdy komórki transfekowane nieaktywnym rybozymem nie wykazywały żadnej naprawy (n = 11) (Figura 3). Nie wykryto zdarzeń trans-splicingu w nietransfekowanych komórkach stabilnych wobec T268M (n = 4) lub kontrolach mieszanych (n = 4). Figura 3: Skuteczność reakcji łączenia splotów. Przeprowadzono ilościowy RT-PCR w czasie rzeczywistym w celu oceny skuteczności reakcji trans-splicingu w puli komórek. Komórki stabilne wobec T268M transfekowano rybozymem lub nieaktywnym rybozymem. Zastosowano kontrolę mieszania, w której komórki HEK-293 potraktowane rybozymem i nietransfekowane komórki stabilne wobec T268M połączono przed izolacją RNA. Paski błędów wskazują SEM. Czynniki potencjalnie wpływające na wydajność trans-splicingu. Kilka czynników może przyczyniać się do niskiej skuteczności naprawy RNA obserwowanej w naszych badaniach, w tym niewystarczającego nadmiaru rybozymu lub niedostatecznej kolokalizacji rybozymu i docelowych RNA. Ilościowy RT-PCR zastosowano do oceny względnego poziomu rybozymu i RNA T268M. W naszych doświadczeniach trans-splicingu, nadmiar rybozymu wynosił 7,6. 0,3 (n = 12). Lokalizacja RNA w przedziałach komórkowych jest czasami dyktowana przez obecność sygnałów działających w układzie cis w obrębie 3. UTR (16, 17). Jednak włączenie kompletnego 3. UTR cClC-1 w obrębie 3. Ekson nie poprawił znacząco wydajności naprawy RNA (1,4%. 0,1%, n = 8). Ratowanie funkcji kanału chlorkowego. Ponieważ kierujemy się uszkodzonym kanałem jonowym do naprawy, możemy bezpośrednio ocenić przywróconą aktywność białka w pojedynczych komórkach za pomocą technik elektrofizjologicznych. Cała konfiguracja z użyciem techniki patch clamp została wykorzystana do rejestracji prądów chlorkowych w stabilnych komórkach T268M po przejściowej transfekcji aktywnego lub nieaktywnego plazmidowego DNA kodującego rybozym. Figura 4, aib, ilustruje typowe ślady prądu uzyskane z komórek wyrażających cClC-1 albo T268M typu dzikiego. Prądy w pełnych komórkach przenoszone przez cClC-1 typu dzikiego wykazują szybką aktywację i dezaktywację w hiperpolaryzujących potencjałach i brak prądu w potencjałach depolaryzacji (Figura 4a). Jednak w komórkach z ekspresją T268M, hiperpolaryzacja błony powoduje natychmiastowe wzrosty amplitudy prądu wewnętrznego, po którym następuje wolniejsza dezaktywacja do stanu ustalonego, podczas gdy depolaryzacja błony wyzwala powoli aktywujące prądy na zewnątrz (Figura 4b). Różnice te wynikają z przesunięcia zależności napięcia od aktywacji do bardziej dodatnich potencjałów w mutancie, co powoduje, że mniej kanałów jest dostępnych dla repolaryzacji sarko-chromalnej (13). Korekta tego biofizycznego defektu mogłaby znieść mio-toniczny fenotyp związany z tą mutacją. Figura 4 Mechaniczna czynność naprawy zmutowanego cClC-1, w której pośredniczy orientobibym. (aib) Reprezentatywne rejestracje napięciowych pełnokomórkowych komórek HEK-293 przejściowo eksprymujących cClC-1 (a) typu dzikiego i trwale eksprymujących T268M (b). (c. f) Reprezentatywne ślady prądu końcowego z cClC-1 (c), T268M (d) typu dzikiego i dwie komórki transfekowane rybozymem: pełna naprawa (e) i częściowa naprawa (f). Bieżące ścieżki rejestrowane przy. 120 mV po impulsie 0-mV są pokazane jako pogrubione czarne linie w c. F. Przeprowadziliśmy podobne analizy elektrofizjologiczne na komórkach transfekowanych plazmidami kodującymi aktywny lub nieaktywny rybozym i EGFP jako reporter. Testowane były tylko komórki pozytywne wobec EGFP. Figura 4, cf, ilustruje reprezentatywny a. Ogon. prądy z komórki cClC-1 typu dzikiego, komórki T268M i dwóch komórek transfekowanych rybozymem. W tym doświadczeniu zmierzono prądy końcowe przy potencjale testowym wynoszącym. 120 mV (strzałka na figurze 4) i reprezentują aktywność kanałów otwartych przez poprzednie napięcie
[podobne: kalprotektyna, kobalamina, kaki kalorie ]