Funkcjonalna naprawa zmutowanego kanału chlorkowego przy użyciu rybozymu z poprzecznym splicingiem

Naprawa RNA została zaproponowana jako nowa strategia terapeutyczna oparta na genach. Zmodyfikowane rybozymy intronowe z grupy I Tetrahymena zastosowano do pośredniczenia w trans-splicingu terapeutycznie istotnych transkryptów RNA, ale skuteczność procesu naprawy RNA za pośrednictwem rybozymu nie została dokładnie określona, a późniejsze odtworzenie funkcji białka zostało wykazane tylko pośrednio. Skonstruowaliśmy rybozym, który celuje w mRNA zmutowanego psiego kanału chlorku mięśnia szkieletowego (cClC-1) (mutacja T268M w ClC-1 powodująca miotonię congenita) i zastępuje 3. część poprzez trans-splicing odpowiedniej sekwencji 4-kb typu dzikiego. Wydajność naprawy oceniana za pomocą ilościowego RT-PCR wynosiła 1,2%. 0,1% w populacji leczonych komórek. Jednakże, gdy badano funkcję kanału chlorkowego w pojedynczych komórkach, obserwowano szeroki zakres aktywności elektrofizjologicznej, z 18% komórek wykazujących znaczną odnowę funkcjonalną i niektóre komórki wykazujące całkowite uratowanie fenotypu biofizycznego. Wyniki te wskazują, że naprawa RNA może przywrócić aktywność białkową typu dzikiego i ujawnić znaczną zmienność między komórkami w wydajności reakcji transkrybowania za pośrednictwem rybozymu. Wprowadzenie Postępy w genetyki molekularnej sprzyjają rozwojowi nowych podejść terapeutycznych, takich jak terapia oparta na genach, w leczeniu zaburzeń dziedzicznych. Najczęściej stosowana strategia polega na wprowadzeniu sekwencji typu dzikiego do komórek z wadliwym genem. Ta strategia najlepiej nadaje się do leczenia dziedzicznych chorób, w których występuje całkowity brak funkcjonalnych alleli, takich jak zaburzenia recesywne. Jednak nie jest jasne, czy takie podejście odniesie sukces we wszystkich zaburzeniach, szczególnie tych z dominującym negatywnym mechanizmem patogenezy choroby. Strategie wykorzystujące naprawę mRNA są alternatywnymi podejściami, które koncepcyjnie będą działać zarówno w zaburzeniach dominujących, jak i recesywnych (1). Zastąpienie uszkodzonej części cząsteczki mRNA zmniejsza udział zmutowanych transkryptów i zwiększa bezwzględny poziom normalnego (lub naprawionego) transkryptu. Zaletą tej strategii jest to, że docelowy mRNA pozostaje pod kontrolą jego endogennego promotora, zapewniając w ten sposób odpowiednią regulację ekspresji, a specyficzność tkankową osiąga się przez celowanie mRNA tylko w komórkach wyrażających zmutowany gen. Naprawę RNA przeprowadzono dwoma podobnymi metodami: splicingiem mediowanym spliceosomem (2) i trans-splicingiem z udziałem rybo-zyme (3-6). Intronowy ryozym Tetrahymena grupy I został zmodyfikowany w celu ułatwienia trans-splicingu jego 3. ekson na oddzielne cząsteczki RNA w sposób specyficzny dla sekwencji (7, 8). Ta reakcja trans-splicingu jest inicjowana przez komplementarne parowanie zasad docelowego RNA z wewnętrzną sekwencją kierującą rybozymem (IGS). Rybozym następnie katalizuje rozszczepienie docelowego RNA bezpośrednio za miejscem wiązania IGS, a następnie ligację jego 3. ekson do pozostałego docelowego RNA, generując kompletny naprawiony transkrypt RNA. Trans-splicing pośredniczony przez rybozym stosowano do naprawy uszkodzonej kinazy białkowej (-globin (9), dystrofii miotonowej (10) i transkryptów p53 (11) w hodowanych komórkach ssaczych. Do tej pory najdłuższy trans-spliced 3. Egzon wynosił 1,1 kb (11), ale nie określono zdolności rybozymu Tetrahymena do pośredniczenia w trans-splicingu większych eksonów. Ponadto, skuteczność reakcji trans-splicingu nie została dokładnie zmierzona w systemie opartym na komórkach. Co ważne, naprawione transkrypty muszą zostać przetłumaczone na funkcjonalne białko, ale tylko jedno badanie wykazało przywróconą funkcję białka określoną pośrednio w lizatach z populacji komórek (11). Aby dokładniej zbadać wykonalność naprawy RNA, zaprojektowaliśmy i przetestowaliśmy zdolność zmodyfikowanego rybozymu Tetrahymena do pośredniczenia w transkrypcji transkryptu mute transkryptu mRNA z mysiego kanału szkieletowego mięśnia szkieletowego psa (cClC-1), który powoduje wrodzone zaburzenie miotonia congenita
[hasła pokrewne: kalorie banan, kalprotektyna, kalarepa kalorie ]