kliniki neurochirurgii uniwersyteckiego szpitala klinicznego we wrocławiu

Wszystkie sekwencje rybozymu zostały potwierdzone przez analizę sekwencji DNA. Naprawa RNA in vitro. Komórki HEK-293 stabilne wobec T268M (komórki T268M stabilnie wyrażające się) i komórki HEK-293 transfekowano 8 .l pRcCMV-RzU712AS lub pRcCMV-RzdU712AS przy użyciu Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp.) w szalkach 60 mm. Po trypsynizacji, całkowite RNA wyizolowano z komórek po 20 godzinach odczynnikiem RNA-4PCR (Ambion Inc.). Jako reakcję kontrolną, transfekowane pRcCMV-RzU712ASP komórki HEK-293 i nietransfekowane komórki stabilne pod względem T268M mieszano bezpośrednio przed izolacją RNA. RNA poddano odwrotnej transkrypcji przy użyciu cClC-1,3 .. specyficzny dla egzonów starter (cClC-1-1556R) z zastosowaniem AMV-RT (Promega Corp.). cDNA amplifikowano przez 35 cykli za pomocą zestawu starterów specyficznych dla allelu, który wzmacnia jedynie produkty ze spiekaniem trans (cClC-1-279F i SJ6-R lub ST-R) przy użyciu polimerazy Advantage 2 (CLONTECH Laboratories Inc.). Produkty splicingowe trans sklonowano do wektorów plazmidowych i zsekwencjonowano przy użyciu starterów M13F i M13R. Ilościowy RT-PCR. Startery PCR i sondy TaqMan zaprojektowano przy użyciu Primer Express wersja 1.5 (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA). Czy barwnik fluorescencyjny reporter przy 5. koniec sondy to VIC i barwnik wygaszający przy 3. Koniec to TAMRA. Amplifikację i detekcję przeprowadzono przy użyciu ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Całkowity RNA (800 ng) wyizolowany z pCMS-EGFP-RzU712AS. lub komórki stabilne wobec T268M pCMS-EGFP-RzdU712ASP poddano odwrotnej transkrypcji i zamplifikowano w reakcji 50-P przy użyciu odczynników TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems) z następującymi parametrami cyklicznymi: 30 minut przy 48 ° C C, 10 minut w 95 ° C i 40 cykli 15 sekund w 95 ° C i minuta w 59 ° C. Końcowe stężenia starterów i sondy wynosiły odpowiednio 900 nM i 250 nM. Reakcje kontrolne bez matrycy były zawsze uwzględniane w celu zapewnienia, że składniki reakcji były wolne od zanieczyszczenia DNA. Liczbę cykli progowych określono przy użyciu oprogramowania Sequence Detection System (Applied Biosystems) z linią bazową ustawioną na dziesięć SD powyżej poziomu tła mierzonego podczas pierwszych 3. 15 cykli. Standardowe krzywe zostały wygenerowane przez wykreślenie wartości progowych liczby cykli względem logu ilości wejściowego plazmidowego DNA reprezentującego produkty trans-splicowane lub nierupowane, lub rybozym lub RNA T268M. Względne ilości nieznanych próbek RNA zostały wywnioskowane ze standardowych wzorów krzywych: produkty ze spiekaniem trans, y = 1,4165ln (x) + 31,735; produkty niesprzężone, r = 1,4692ln (x) + 31,755; rybozym, y = 8 1,3365ln (x) + 36,735; i RNA T268M, y = 1,4126ln (x) + 38,185. Proporcję sekwencji połączenia trans-splotu z całkowitą docelową sekwencją obliczono następująco: procent naprawy RNA = [produkty trans-splicowane / (produkty trans-splicingowe + produkty niepodzielone, skorygowane pod względem wydajności transfekcji)] × 100. Stosunek rybozymu do RNA T268M obliczono następująco: stosunek = RNA rybozym / T268M, skorygowany pod względem wydajności transfekcji. Dwupromiennikowe bicistronowe plazmidy, pCMS-EGFP-RzU712AS i pCMS-EGFP-RzdU712AS, kodują EGFP jako oddzielny transkrypt, umożliwiając określenie skuteczności transfekcji jako procent komórek zielonych mierzonych przy użyciu hemocytometru w epifluorescencji w ultrafiolecie. Badania elektrofizjologiczne. Prądy w pełnych komórkach w komórkach wyrażających cClC-1 (mutant typu dzikiego, T268M i mutanta T268M z pCMS-EGFP-RzU712AS lub pCMS-EGFP-RzdU712AS) rejestrowano za pomocą Axopatch 200A (Axon Instruments Inc., Foster City, California, USA) w konfiguracji całokomórkowej techniki patch clamp (12). W badaniach transfekcji rybozymem analizowano tylko komórki pozytywne pod względem EGFP. Zbieranie i analizę danych przeprowadzono przy użyciu pCLAMP 7.0 (Axon Instruments Inc.)
[podobne: jarmuż właściwości, jaskolcze ziele, klasterowe bóle głowy ]