najlepsi ginekolodzy w rzeszowie

Wykazaliśmy, że ten rybozym może pośredniczyć w trans-splicingu dużego (4 kb) 3. ekson w hodowanych komórkach. Ponadto, mierzyliśmy wydajność reakcji tran-splicingu w komórkach i badano funkcję kanału chlorkowego na poziomie pojedynczej komórki. Chociaż ogólna wydajność reakcji określona w populacji komórek była niska (1,2%), kilka komórek wykazywało częściowe lub całkowite przywrócenie normalnej funkcji kanału. Odkrycia te dowodzą, że naprawa RNA może w pełni przywrócić aktywność białka typu dzikiego w komórkach zawierających zmutowany RNA. Jednakże wskazują one również na wysoki stopień zmienności między komórkami w trans-splicingu pośredniczonym przez rybozym. To, co wyjaśnia tę zmienność, jest niejasne, ale lepsze zrozumienie wymagań dotyczących takiej naprawy genetycznej w komórkach ssaków może pozwolić na opracowanie strategii naprawy RNA, które mogą przywrócić funkcję typu dzikiego większemu odsetkowi leczonych komórek. Metody Test dostępności witryny. Bibliotekę do mapowania losowego IGS RNA skonstruowano przy użyciu rybozymu z poprzecznym łączeniem trans Tetrahymena grupy I tak, że 5. koniec rybozymu zaczyna się od 5 (3-GNNNNN-3. (G oznacza guaninę, a N oznacza równe ilości czterech nukleotydów: adeniny, guaniny, cytydyny lub urydyny), jak opisano wcześniej (9). Test 3. Egzon w tym doświadczeniu składał się z ludzkiej sekwencji ClC-1 (hClC-1) (nukleotydy 2,674. 2,998). Do transkrypcji in vitro docelowego RNA, jako linearnę wykorzystano linearyzowany plazmid Bsu36I kodujący ClC-1 (cClC-1). Bibliotekę mapowania RNA i RNA cClC-1 poddano transkrypcji in vitro przy użyciu polimerazy T7 z układem MEGAscript (Ambion Inc., Austin, Texas, USA). 30-krotny nadmiar biblioteki rybozymu i RNA cClC-1 denaturowano oddzielnie w 95 ° C przez minutę, a następnie wstępnie zrównoważono w buforze reakcyjnym (w mM: 50 HEPES, pH 7,0, 150 NaCI i 5 MgCl2) w 37 ° C. ° C przez 2 minuty. Substraty dodano do biblioteki rybozymu wraz z guanozyną (100 (iM) i inkubowano w 37 ° C przez 4 godziny. Produkty reakcji tranzytu poddawano odwrotnej transkrypcji z zastosowaniem AMV-RT (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) i amplifikowano PCR (Advantage 2 Polymerase; CLONTECH Laboratories Inc., Palo Alto, California, USA) stosując następujące primery: odwrotna transkrypcja , hClC-1 2855R; naprzód, cClC-1 -92F; reverse, hClC-1 2772R (sekwencje primerów dostępne na życzenie). Produkty PCR subklonowano do wektora plazmidowego (pCR2.1-TOPO-TA, Invitrogen Corp., Carlsbad, California, USA) i sekwencjonowano. Budowa rybozymu. Aktywne (RzU712AS) i nieaktywne (RzdU7712AS) rybozymy wytworzono przy użyciu mutagenezy PCR, uzyskując produkt zawierający cały intron Tetrahymena (rdzeń katalityczny) z ukierunkowaną na U712 dziewięciukleotydową IGS, helisą P10 i antysensownym regionem 33-nukleotydowym na 5 . koniec. Jako szablony zastosowano plazmidy pT / S lub pT / Sd (hojne prezenty od T. Cech, Howard Hughes Medical Institute, Chevy Chase, Maryland, USA). Jedna część 3. Egon wygenerowano przy użyciu mutagenezy PCR w celu wprowadzenia 15 cichych mutacji do 5. koniec fragmentu cClC-1. Ssacze ekspresyjne plazmidy kodujące aktywne (pRcCMV-RzU712AS) i katalitycznie nieaktywne (pRcCMV-RzdU712AS) rybozymy skonstruowano przez ligację trawionego Hindlll-Scal-core rdzenia katalitycznego, cCIC13-3, trawionego ScaI-AgeI2. ekson i fragmenty pRcCMV-cClC-1 trawione AgeI-Hindlll .. Ostateczne konstrukty zawierają 4,005-zasadę 3. ekson składający się z nukleotydów cClC-1 713. 4,717. Podwójnie promotorowe bicistronowe plazmidy kodujące zarówno wzmocnione białko o zielonej fluorescencji (EGFP), jak i aktywne rybozymy (pCMS-EGFP-RzU712AS) lub nieaktywne (pCMS-EGFP-RzdU712AS) skonstruowano przez subklonowanie fragmentu Hindlll-XbaI zawierającego rybozym, który zawiera 3,217- baza 3. ekson do miejsca wielokrotnego klonowania pCMS-EGFP (CLONTECH Laboratories Inc.)
[podobne: jak szybko obniżyć ciśnienie, kminek właściwości, kiełki słonecznika ]