przychodnia starzyńskiego szczecin usg

Stwierdziliśmy, że CEP290 / NPHP6, ALMS1 i LRRC50 są skutecznie rozszczepiane przez ecAPP (Figura 5C). Przeciwnie, peptydy zawierające reszty inne niż prolina w drugim położeniu nie mogą być przetwarzane przez ecAPP (dane nie pokazane). Co ważne, aktywność enzymu odszczepiającego się nie jest rozwiązła, ponieważ stwierdziliśmy, że barwnikowe, inne białko rzęskowe, które zawiera również prolinę w drugiej reszcie, ale nie uczestniczy w torbielowatych chorobach nerek, jest słabo trawione przez ecAPP (Figura 5C). Te dane sugerują, że rozszczepienie XPNPEP3 innych białek cystogennych może mieć znaczenie dla ich funkcji biologicznych. Figura 5 Wycinanie peptydu przez ortolog XPNPEP3, ecAPP. (A) Ekspresja i oczyszczanie ecAPP. Wykreślono barwnik Coomassie oczyszczonego białka (ścieżka 1) i immunoblot z przeciwciałem przeciwciałem anty-His (linia 2). (B) Substraty peptydowe przeznaczone do testu enzymatycznego. Strzałki wskazują miejsce (miejsca) cięcia. Resztki proliny rozpoznawane przez ecAPP zaznaczono na czerwono. Ciężary cząsteczkowe podano w Da. BN, bradykinina; N6, CEP290 / NPHP6; AL, ALMS1; LR, LRRC50; DN, dyneina. (C) Rozszczepienie peptydu wykryto metodą jonizacji przez elektrorozpylanie. Chromatografii cieczowej. Spektrometrii masowej. Przedstawiono spektrometrię mas peptydów przed i po trawieniu. M + nH oznacza dodanie n protonów do masy po jonizacji. intensywność, intensywność. Wymaganie N-końcowego rozszczepienia XPNPEP3 do wczesnej gastrulacji u danio pręgowanego. Aby zbadać znaczenie prawdopodobnych miejsc rozszczepienia XPNPEP3 in vivo, zapytaliśmy, czy oporność na cięcie jest szkodliwa dla funkcji białka. Koncentrując się na LRRC50 (każdy z mRNA kodujący CEP290 / NPHP6 i ALMS1 ma więcej niż 7 kb, co sprawia, że są one trudne do transkrypcji in vitro przy dostatecznej czystości), zbadaliśmy, czy odporny na rozszczepienie mRNA z ludzkim czapeczką może uratować fenotypy gastrulacji spowodowane przez MO tłumienie endogennego lrrc50. Wstrzyknięcie 4,5 ng blokujących translację MO indukowanych fenotypów wczesnego gastrulacji, które obejmują wszystkie cechy charakterystyczne zbieżnych zbieżnych defektów rzęsek i które można uratować przez rzutowanie 150 .g mRNA LRRC50 z ludzkim czapeczką (fig. 6). Jednak jednoczesne oznaczanie MO z mRNA kodującym N-końcową mutację punktową Pro-Val, a następnie ślepy punkt zarodków, wykazało całkowite niepowodzenie ratowania (WT vs. Pro-Val, <2 = 39,20, P <0,0001; n = 80; . 110 zarodków / wstrzyknięcie). Ten eksperyment nie mógł wykluczyć, że obserwowana utrata funkcji mogła być spowodowana obecnością Val w tej pozycji. Jednak powtórzenie tego testu za pomocą Asp lub Arg dało podobne dane (rysunek 6). Nadal jednak istnieje możliwość, że obserwowane niepowodzenie akcji ratunkowej może być nadal spowodowane utratą proliny z powodów innych niż dekapitacja. Aby ocenić tę możliwość, przeszukiwaliśmy genom danio pręgowanego dla innych aminopeptydaz N-terminalnych i zidentyfikowaliśmy aminopeptydazę alanylową (ZFIN ID, ZDB-Gene-030131-1253), która przewiduje, że Ala w pozycji N-końcowej proliny powinna dawać lrrc50 podlega rozszczepieniu. Zgodnie z poglądem, że jest to cięcie, które funkcjonalizuje lrrc50, wstrzyknięcie MO z ludzkim mRNA kodującym Ala uratowało fenotypy w sposób nieodróżnialny od WT (Figura 6;> 2 = 0,26, P <0,87). Figura 6N-końcowe cięcie LRRC50 jest wymagane do uratowania fenotypów morfantu lrrc50 u danio pręgowanego. (A) Ilościowe przedstawienie wpływu lrrc50 MO na rozwój gastrulacji i skuteczność ratowania różnych ludzkich izoform RNA dla lrrc50. Fenotyp rozwojowy zarodków był oceniany jako klasa I (II, jak opisano poprzednio (22). Normalny, nie do odróżnienia od WT; Klasa I, łagodnie dotknięta skróconą osią ciała, małymi strukturami przednimi, łagodnymi somitami; Klasa II, poważnie dotknięta krótką osią ciała, źle określona głowa i oczy, poszerzenie i załamanie struny grzbietowej, szerokie, cienkie somty i defekty przedłużenia ogona [patrz też: kłykciny kończyste leczenie, jaskolcze ziele, kiełki słonecznika ]