skleroterapia jelenia góra

Królicze poliklonalne a-XPNPEP3 pochodziło z Sigma-Aldrich (HPA000527). Wtórne przeciwciała przeciwko króliczym, mysim i kozim IgG skoniugowano z Alexa Fluor 488 lub 594 (Molecular Probes). Przeciwciała dla a-aktyny i acetylowanej a-tubuliny i a-tubuliny pochodziły z Sigma-Aldrich; V5 pochodziło z Invitrogen; a perycentrin pochodzi z Novus. Przeciwciało akwaporyny-2 było kozim przeciwciałem poliklonalnym z Santa Cruz Biotechnology Inc. (sc-9882). Przeciwciałem oksydazy cytochromu C było mysie przeciwciało monoklonalne z Santa Cruz Biotechnology Inc. (sc-658348). Klonowanie. Pełnej długości XPNPEP3 i AN-XPNPEP3 (aminokwas 79a507) zamplifikowano przez PCR z pENTR-XPNPEP3 (NM_022098.2, klon IOH5999, Invitrogen), z kodonem terminacji usunięto i wstawiono do wektora pDONR221, stosując BP Clonase II (Invitrogen), a następnie przeniesiono do pEF5 / FRT / V5-DEST (Invitrogen) i pG-LAP5 (C-końcowy znacznik GFP-Lap) (45) lub pCS2 +, stosując LR Clonase II (Invitrogen). Ludzki LRRC50 wklonowano do wektora pCS2 +; Wektory kodujące zmutowany LRRC50, z trzecią resztą proliny zastąpioną przez alaninę, walinę, kwas asparaginowy lub argininę, wytworzono przez ukierunkowaną mutagenezę. Wierność wszystkich konstruktów została potwierdzona przez analizę sekwencji. MitoProt II został użyty do prognozowania sygnału lokalizacji mitochondrialnego (MitoProt, http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/mitoprot.html). Immunoblot. Immunoblot przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (9). W badaniach frakcjonowania mitochondrialnego, całe nerki z 6-miesięcznych samców myszy 129S6 wyizolowano, homogenizowano i frakcjonowano za pomocą wirowania różnicowego w frakcje mitochondrialne i cytosolowe. Następnie 50. G białka całkowitego z każdej frakcji załadowano i rozdzielono na denaturującym gradiencie żelowym SDS-PAGE o 4%. 12% i przeniesiono na membranę PVDF. Całkowite białko wizualizowano stosując barwienie Ponceau S. Membrany poddano następnie immunoblottingowi przy użyciu a-XPNPEP3 przez noc w temperaturze 4 ° C przy mianie 1: 500. Mikroskopia immunoelektronowa. Kora nerki i rdzeń od 4-miesięcznych szczurów Sprague-Dawley wykorzystano do analizy immunocytochemicznej. Tkanki utrwalano lekko przez 5 minut w 4 ° C przy użyciu 3% formaldehydu i 20 mM etyloacetimidanu w soli fizjologicznej buforowanej HEPES (30 mM HEPES, 151 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 7,8 mM glukozy, pH 7,3) w temperaturze 4 ° C. DO. Te próbki przemyto, następnie utrwalono w 3% formaldehydzie zawierającym 0,25% glutaraldehydu w soli fizjologicznej buforowanej HEPES w temperaturze 4 ° C przez 45 minut, a następnie odwodniono w etanolu i zatopiono w LR White Resin (Polysciences Inc.). Cienkie skrawki blokowano PBS zawierającym 1% wag./obj. BSA i 0,01% obj./obj. Tween 20 (PBT). Następnie siatki inkubowano z a-XPNPEP3 (HAP000527, Sigma-Aldrich) w rozcieńczeniu 1:10 i 1:25 w PBT przez 12 godzin w 4 ° C. Kontrole negatywne obejmowały normalną surowicę króliczą i zastąpiono PBT jako pierwotne przeciwciało. Po płukaniu, siatki inkubowano przez godzinę w 10-nm sprzężonej ze złotem koziej anty-króliczej IgG (Amersham Life Sciences) rozcieńczonej 1:30 w PBT, przepłukano PBS i utrwalono za pomocą aldehydu glutarowego w celu stabilizacji cząstek złota. Próbki barwiono octanem uranu i cytrynianem ołowiu, a następnie badano w mikroskopie elektronowym Zeiss CEM902. Hodowli tkankowej. XPNPEP3-V5. i linie komórkowe wyrażające XPNPEP3-LAP . wytworzono przez kotransfekcję komórek IMCD3 Flp-In (Invitrogen) za pomocą pOG44 i pDEST EF / FRT XPNPEP3-V5 lub pG-LAP5-XPNPEP3, zgodnie z instrukcjami producenta. Stabilne komórki wytworzono przez selekcję higromycyną (800 .g / ml). Pomiary czynności mitochondrialnego kompleksu oddechowego przeprowadzono w próbkach biopsji mięśniowej z rodziny F543, jak opisano wcześniej (46, 47). W indywidualnym A131 II-4 wyizolowano mitochondria z próbki biopsji mięśniowej metodą Rasmussena i wsp.
[patrz też: kłykciny kończyste objawy, jaskolcze ziele, kardiowersja elektryczna ]