stomatolog sicienko

Po inkubacji przez godzinę w 34 ° C w 8% CO2, monowarstwy keratynocytów przemywano dwukrotnie w celu usunięcia nieprzylegających bakterii, następnie liczbę bakterii związanych z komórkami określano przez hodowlę ilościową po uwolnieniu keratynocytów za pomocą trypsyny i lizie w sterylnej wodzie. . Doświadczenia testujące wpływ egzogennego kwasu hialuronowego na przywieranie GAS przeprowadzono z użyciem mysiej linii komórkowej keratynocytów, PAM 2.12 (26). Komórki wysiano w studzienkach hodowli komórkowej opłaszczonych kolagenem w 105 komórkach na studzienkę, hodowano przez 3 dni w 37 ° C w 5% CO2, a następnie inokulowano 106 CFU GAS na dołek w pożywce zawierającej egzogenny kwas hialuronowy (z grzebienia koguta; Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA), bez inhibitora lub kontrolnego polisacharydu, kwasu alginowego, wysokocząsteczkowego polimeru kwasu mannuronowego i kwasu guluronowego (protonowa alginian Durvillea, Pronova Biopolymer Inc., Portsmouth, New Hampshire, USA). Komórki inkubowano przez 45 minut w 37 ° C w 5% CO2 i następnie przetwarzano w celu wyliczenia adherentnych bakterii, jak już tu opisano. W doświadczeniach mających na celu sprawdzenie, czy egzogenny kwas hialuronowy może sprzyjać dysocjacji GAS związanego z keratynocytami, GAS mógł przyłączyć się do keratynocytów bez inhibitora; po 45 minutach podłoże usunięto i zastąpiono świeżą pożywką zawierającą kwas hialuronowy, bez inhibitora lub kwasu alginowego. Po 45 minutach inkubacji liczbę przylegających bakterii wyliczono, jak już opisano. Badania kolonizacji gardła in vivo. W doświadczeniach kolonizacji gardła, samice myszy w wieku 4 do 6 tygodni znieczulono przez inhalację metoksyfluranu, następnie inokulowano donosowo około 5 x 106 CFU GAS w 20 ul PBS, pH 7,4. Wymazy z gardła pobierano od znieczulonych myszy codziennie i umieszczano na agarze Todd-Hewitt-blood zawierającym 500 .g / ml streptomycyny w celu zahamowania wzrostu normalnej flory. Dla niektórych eksperymentów inokulum bakteryjne zawieszono w PBS zawierającym 50 .g mAb, albo KM81 skierowany na CD44 albo dopasowane do izotypu, niezwiązane z kontrolą mAb, 4H1. Badanie za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej komórek GAS inkubowanych z mAb nie ujawniło wiązania mAb z tymi organizmami. Immunohistochemia. Zatopione w parafinie skrawki tkanek przez mysią gardła zostały odparafinowane, jak opisano wcześniej (10). Skrawki inkubowano z 0,1% nadtlenkiem wodoru w celu zahamowania endogennej aktywności peroksydazy, następnie inkubowano przez godzinę z 1,5% normalną surowicą króliczą, a następnie z mAb KM81, 15 .g / ml, przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Skrawki przemyto PBS, następnie inkubowano ze skoniugowanym z biotyną króliczym anty-szczurzym IgG, a następnie peroksydazą chrzanową-streptawidynę i substratem peroksydazy, tetrahydrochlorek diaminobenzydyny (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA). Szkiełka badano pod mikroskopem optycznym i fotografowano przy powiększeniu 400x w standardowych warunkach. Analiza statystyczna. Różnice w przyłączaniu GAS do keratynocytów oceniano za pomocą testu U Manna Whitneya (Instat wersja 1.12, GraphPad Software for Science Inc., San Diego, Kalifornia, USA). W badaniach in vivo kolonizacji gardła u myszy transgenicznych, dokładny test Fishera zastosowano do oceny istotności różnic między grupami w proporcji zwierząt z dodatnimi posiewami gardła w dniu 4 lub 5 (Instat wersja 1.12). W badaniach blokowania kolonizacji u myszy typu dzikiego zastosowano powtarzalne pomiary regresji logistycznej w celu zbadania wpływu działania mAb anty-CD44 lub egzogennego kwasu hialuronowego na odsetek myszy z dodatnimi hodowlami gardła w ciągu 3 dni obserwacji (27). Wyniki GAS przyłączenia do mysich keratynocytów in vitro odbywa się przez wiązanie polisacharydu otoczkowego GAS z CD44
[więcej w: olx międzyrzec podlaski, jęczmień zielony opinie, olx wielun ]