stomatologia mszczonów

Wykazano, że ubytek kilku białek cystogennych, w tym NPHP2, CEP290 / NPHP6 i licznych białek BBS, zaburza ruchy konwergencji i wydłużania u danio pręgowanego (18, 22, 25, 35), nietypowego fenotypu Wnt, który w manifestacjach nefronów u ssaków jako niepowodzenie orientacji osi podziału komórki i zostało przyczynowo związane z rozszerzeniem rurkowatym (20). W związku z tym zastanawialiśmy się, czy supresja xpnpep3 może wywołać fenokopię tej wady, czy też utrata tego genu / białka może wpłynąć na nieznane dotąd szlaki. Dlatego zaprojektowaliśmy blokujące translację morfolino (MO) przeciwko jedynemu ortologowi Daniorerio (przez odwrotność BLAST), transkryptowi, który jest wyrażany już po 12 godzinach po zapłodnieniu, jak określono za pomocą RT-PCR (dane nie pokazane). Na etapie mid-somite zarodki wstrzyknięte przez xpnpep3 MO (n = 50. 100 zarodków / iniekcji, ocenione jako ślepe) wykazywały mierzalne defekty gastryczne przypominające morfanty komórek rzęskowych (22, 25, 35); obejmowały one skróconą oś ciała, małe struktury przednie, poszerzenie i załamanie struny grzbietowej oraz wydłużone stawy (Supplemental Figure 6). Te fenotypy prawdopodobnie nie były spowodowane niespecyficznym działaniem MO: nie tylko obserwowaliśmy wzrost dotkniętych zarodków skorelowanych z dawką, ale ratowanie z użyciem pełnej długości mRNA ludzkiego XPNPEP3 o pełnej długości spowodowało znaczące złagodzenie fenotypu (. 2 = 34,45 P <0,0001). Te fenotypy prawdopodobnie są niezależne od aktywności mitochondrialnej XPNPEP3: rzut monetarny MO z xpnpep3 z ludzkim konstruktem ratunkowym pozbawionym mitochondrialnego sygnału lokalizacyjnego (AN-XPNPEP3) uratował fenotyp w sposób nie do odróżnienia od ludzkiego konstruktu WT (. 2 = 3,47, P = 0,17). Dlatego nie jest wymagane ukierunkowanie XPNPEP3 na mitochondrium w celu uratowania fenotypów konwergencji i wydłużania, co sugeruje, że to białko może również mieć aktywność niezależną od mitochondriów. Rozszczepienie znanych białek chorób torbielowatych za pomocą XPNPEP3. Nasze dane doprowadziły nas do hipotezy, że oprócz funkcji mitochondrialnych (które potencjalnie wyjaśniają defekty RCCI obserwowane w rodzinie F543), XPNPEP3 może wpływać biochemicznie na funkcjonowanie białek rzęskowych, najprawdopodobniej poprzez N-końcową aktywność rozszczepiania proliny. Aby zidentyfikować takie substraty kandydatów, przeanalizowaliśmy proteom rzęskowy (28) dla białek z proliną w drugiej pozycji (po N-końcowym rozszczepieniu metioniny). Aby zmniejszyć częstość występowania fałszywych wyników dodatnich, zastosowaliśmy rygorystyczną wersję proteomu, która była ograniczona do wzajemnych ortologów (minimalna wartość E wynosząca 10 30 30) zidentyfikowanych w co najmniej 2 niezależnych badaniach rzęskowych, tym samym analizując 426 prawdopodobnych białek rzęskowych pod kątem kandydatury substratu. Zidentyfikowaliśmy 51 białek z sekwencjami, które spełniły nasze kryteria wyszukiwania (Tabela dodatkowa 8). Co ciekawe, 3 potencjalne substraty (białko centrosomowe 290 kDa / NPHP6 [CEP290 / NPHP6], zespół Alstrom [ALMS1] i powtórzenie bogate w leucyny zawierające 50 [LRRC50]) powodują torbielowatą chorobę nerek (9, 36, 37). Aby zweryfikować nasze przewidywania obliczeniowe, następnie próbowaliśmy sprawdzić, czy XPNPEP3 może odciąć te 3 kandydujące substraty. Ekspresja rekombinowanego ludzkiego XPNPEP3 w bakteriach nie była możliwa, ponieważ białko jest nierozpuszczalne w licznych warunkach doświadczalnych. Dlatego skupiliśmy się na ortologu E. coli XPNPEP3, ecAPP, który byliśmy w stanie wyrazić i oczyścić do ponad 99% homogenności wykrytej przez barwienie Coomassie i Western blot (Figura 5A). Trzy 9-aminokwasowe peptydy identyczne z końcami N każdego z CEP290 / NPHP6, ALMS1 i LRRC50 (bez początku metioniny, która jest cięta po translacji) zsyntetyzowano (Figura 5B) i inkubowano z oczyszczonym ecAPP, a następnie spektrometrią masową. [hasła pokrewne: jarmuż właściwości, kaki kalorie, kłykciny kończyste objawy ]