szczecin ul chopina 22

Wiązanie się hialuronowego kwasu ssaka z białkiem wiążącym kwas hialuronowy CD44 pośredniczy w różnych interakcjach między komórkami a komórkami i macierzą, w tym limfopoezą, naprowadzaniem limfocytów i przerzutami nowotworowymi (19. 21). Obserwacja, że polisacharyd otoczkowy GAS jest molekularnym naśladowaniem ssaczego kwasu hialuronowego sugeruje hipotezę, że kolonizacja gardła przez GAS odzwierciedla subwersję oddziaływania wiązania CD44-kwasem hialuronowym poprzez wiązanie polisacharydu otoczkowego GAS za pośrednictwem CD44. Aby przetestować tę hipotezę, użyliśmy systemu eksperymentalnego u myszy do zbadania interakcji GAS z CD44 na nabłonku gardła in vitro i in vivo. Metody Szczepy bakteryjne i warunki wzrostu. GAS szczep B514-Sm jest spontaniczną oporną na streptomycynę pochodną B514 / 33, szczepu M typu 50 pierwotnie wyizolowanego z epizootycznej infekcji kolonii myszy (22, 23). UAB039 jest acapsularnym mutantem B514-Sm skonstruowanym przez wstawienie niezawierającego plazmidu w obrębie genu hasA (genu hialuronianu) (17). GAS szczep 950771 to szczep M typu 3 pierwotnie wyizolowany od pacjenta z nekrotycznym zapaleniem powięzi; szczep 188 jest zmutowanym szczepem 950771 skonstruowanym przez wstawienie elementu a Km2, kasety oporności na kanamycynę flankowane przez terminatory transkrypcji, w obrębie genu hasA (24). Bakterie hodowano w płynnej hodowli w bulionie Todd-Hewitta lub na agarze z tryptozą sojową zawierającym 5% krwi owczej. GAS hodowano w ciekłej hodowli do fazy środkowej wykładniczej (A650nm = 0,15), płukano i ponownie zawieszano w pozbawionej surowicy podstawowej pożywce keratynocytowej bez wapnia lub suplementów (Clonetics Inc., San Diego, Kalifornia, USA) do testów wiązania in vitro lub w PBS (pH 7,4), do inokulacji donosowej myszy. mAb. s. MAb stosowane w tej pracy to KM81, szczurzy anty-mysie CD44 mAb (20) lub 4H1, dopasowane do izotypu kontrolne mAb skierowane do lipopolisacharydu Pseudomonas aeruginosa (darowane przez M. Prestona, Brighama i Women s Hospital). . Oba przeciwciała oczyszczono przed zastosowaniem za pomocą chromatografii powinowactwa na białku G (GammaBind Plus Sepharose, Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, New Jersey, USA). Odmiany myszy. O ile nie zaznaczono inaczej, doświadczenia z udziałem myszy przeprowadzono z użyciem myszy C57BL / 6 (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA). Transgeniczne myszy K5-CD44 z selektywnym niedoborem ekspresji CD44 w uwarstwionym nabłonku płaskokomórkowym opisano wcześniej (25). Te myszy eksprymują transsensowny antysensowny CD44 pod kontrolą promotora keratyny-5, który celuje w ekspresję transgenu antysensownego do przedziału komórek podstawnych rozwarstwionego nabłonka łuskowego. Wyprowadzenie i charakterystyka głównych keratynocytów myszy. Pierwotne mysie hodowle keratynocytów zostały utworzone z komórek wyizolowanych z naskórka myszy 1- do 3-dniowych. Skórki myszy inkubowano przez noc w 4 ° C w 0,25% trypsynie. Naskórek oddzielono od skóry właściwej i rozdrobniono i mieszano w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczych komórek przed zaszczepieniem na studzienkach hodowlanych do hodowli kolagenowych (Nalge Nunc International, Naperville, Illinois, USA). Hodowle komórkowe inkubowano w temperaturze 34 ° C w 8% CO2 przez 3. 10 dni w pozbawionej surowicy podstawowej pożywce keratynocytowej bez wapnia, uzupełnionej KGM SingleQuots, oryginalna formuła (Clonetics Inc.). Ekspresję CD44 na keratynocytach z każdego zwierzęcia oceniano za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej stosując mAb KM81 (10). Testy adherencji bakterii. W przypadku testów adherencji bakterii, keratynocyty wysiewano w ilości 105 komórek na dołek w studzienkach hodowlanych powleczonych kolagenem (Nalge Nunc International), inkubowano przez 3 dni w temperaturze 34 ° C w 8% C02, przemywano i nakładano na pożywkę zawierającą 106 CFU GAZU. na studzienkę
[hasła pokrewne: inteligencja emocjonalna pdf, kardiowersja elektryczna, osp opalenica ]