szwede radom

Homogenizaty całych komórek nerkowych od myszy podzielono na frakcje mitochondrialne i frakcje cytosolowe. Immunoblot z a-XPNPEP3 dawał pojedynczy prążek w frakcji mitochondriów przy około 51 kDa (linia M1), zgodny z produktem cięcia mitochondrialnego peptydu sygnałowego (po aminokwasie 53), który według przewidywań nastąpił po przywarciu mitochondrialnym. Dublet zaobserwowano we frakcji cytozolowej (linia C2) przy około 57 kDa, która jest kompatybilna z izoformą o pełnej długości XPNPEP3. Ponowne wprowadzenie przeciwciała monoklonalnego przeciwko cytochromowi białka mitochondrialnego c (Cyt C) wykazuje, że cytochrom c jest wzbogacony we frakcję mitochondrialną (linia M3), dając pasmo przy około 15 kDa (grot strzałki), który nie był obecny we frakcji cytozolowej (ścieżka C4). (B) Badanie immunofluorescencyjne przeprowadzono na komórkach IMCD3, które stabilnie wyrażają pełnej długości XPNPEP3-GFP człowieka (w 90% komórek) (lewy panel), który zawiera mitochondrialną sekwencję liderową. Po kosztach ze znacznikiem mitochondrialnym, Mitotracker Red, obserwowano kolokalizację (prawy panel) w mitochondriach. Pasek skali: 10 .m. Izo 1, izoforma 1. (C) Przeciwnie, w komórkach IMCD3, które stabilnie wyrażają amino-końcowy konstrukt delecyjny XPNPEP3-GFP, pozbawiony 53-aminokwasowej N-końcowej mitochondrialnej sekwencji sygnałowej (A N-XPNPEP3-GFP) ( lewy panel), ekspresja XPNPEP3 występowała dyfuzyjnie w cytoplazmie, a nie w mitochondriach (prawy panel). Mitochondria ponownie oznakowano znacznikiem Mitotracker Red. Pasek skali: 10 .m. (D) W celu wykrycia obecności endogennego Xpnpep3 w mitochondriach dystalnych odcinków rurkowych w nerce szczura, a-XPNPEP3 znakowano cząsteczkami złota o wielkości 10 nm. Endogenne znakowanie Xpnpep3 wykryto w mitochondriach dystalnych odcinków rurkowych. Pasek skali: .m. Brak dowodów na występowanie XPNPEP3 w rzęskach pierwotnych, ciałach podstawowych i centrosomach in vitro. NPHP jest uważany za ciliopatię, ponieważ 10 różnych genów sprawczych (NPHP1A NPHP9 i NPHP11) ma wspólną cechę subkomórkowej funkcji ich odpowiednich produktów genowych w rzęskach pierwotnych, ciałach podstawowych lub centrosomach (1). W związku z tym przebadaliśmy XPNPEP3 pod kątem organellarnego targetowania do kompleksu rzęski / ciała podstawowego / centrosomu. W komórkach IMCD3, które stabilnie wyrażają ludzką pełnej długości XPNPEP3-GFP, która zawiera mitochondrialną sekwencję liderową, XPNPEP3-GFP nie wykryto w rzęskach pierwotnych, ciałach podstawowych lub centrosomach (Figura 4). Wnioskujemy, że utrata XPNPEP3 prowadzi do fenotypu podobnego do NPHP (NPHPL1), bez widocznej lokalizacji rzęsek, odejścia od paradygmatu wszystkich innych genów zmutowanych w NPHP. Figura 4 Ludzka długość XPNPEP3-GFP przejściowo wyrażana w komórkach IMCD3 lokuje się w mitochondriach, a nie w kompleksie cilium / ciało podstawowe / centrosom w komórkach IMCD3. Mikroskopię immunofluorescencyjną przeprowadzono w komórkach IMCD3, które stabilnie eksprymują ludzką pełnej długości XPNPEP3-GFP, która zawiera mitochondrialną sekwencję sygnałową, demonstrując ekspresję XPNPEP3 w mitochondriach. XPNPEP3-GFP nie wykryto w rzęskach pierwotnych (A), ciałach podstawowych (B) lub centrosomach (C), gdy barwiono kontrastowo acetylowaną a-tubuliną (Ac -. – tublin) (A),. – tubuliną (B), lub perycentrin (C), odpowiednio (środkowy i prawy panel). Pasek skali: 10 .m. XPNPEP3 wykazuje specyficzną ekspresję typu komórek w nerce. Ponieważ najwyraźniejszy fenotyp u osób z supresją funkcji XPNPEP3 objawiał się w nerce, przeprowadziliśmy immunofluorescencyjną mikroskopię sekcji nerki szczura, aby zbadać specyficzną ekspresję typu komórki. Stwierdzono, że XPNPEP3 ulega ekspresji w komórkach kanalikowych dystalnych i kanalików kory mózgowej (Supplemental Figure 5). Należy zauważyć, że ekspresja XPNPEP3 została wykryta nie w komórkach głównych, ale w komórkach interkalowanych, o których wiadomo, że nie mają rzęsek pierwotnych (Suplementalna Figura 5). xpnpep3 tłumienie fenokopii rzęskopodobnych i wyjściowych morfanów danio pręgowanego
[hasła pokrewne: kalorie banan, kalarepa kalorie, kaki kalorie ]