zadrapania na nogach

Jedna klatka filmu wideo (około 6 godzin) jest wyświetlana przy większym powiększeniu (rysunek 7N, prawy panel), aby wskazać liczne rozszerzenia EC lub filopodia (czarne strzałki) obecne podczas procesu odsunięcia. SEMA3F odpycha komórki PAE NRP2 i komórki HUVEC (Figura 8, A i E). Aby określić, czy indukowana przez SEMA3F odpychanie była zależna od NRP2, użyliśmy RNAi do wyciszenia NRP2. Analiza Western blot i immunocytochemia pokazują, że RNAi NRP2 silnie zmniejsza poziomy białka NRP2 w komórkach PAE NRP2 (Figura 8, B i D) i w komórkach HUVEC (Figura 8H). Ponadto, barwienie immunocytochemiczne dla NRP2 (różowe) pokazuje, że RNAi NRP2 zmniejsza poziomy białka NRP2 w prawie wszystkich komórkach w hodowli (Figura 8, porównaj A z B). Równocześnie odpychające działanie SEMA3F na komórki PAE NRP2 (Figura 8B) i HUVEC (Figura 8F) było silnie hamowane przez RNAi. Podobnie jak w przypadku komórek PAE NRP2 / RNA interferencja (NRP2 / RNAi), nie wystąpiło odpychanie z komórkami PAE NRP1 (Figura 8, porównaj B z C). Na podstawie tych wyników wyciągamy wniosek, że NRP2 jest funkcjonalnym receptorem odpychania EC wywołanego przez SEMA3F. Omówienie Semaforyny, dobrze scharakteryzowane jako regulatory przewodnictwa nerwowego, są również uważane za antagonistów onkogenezy. Wydzielone semaforyny klasy 3 SEMA3B i SEMA3F zidentyfikowano po raz pierwszy w regionach chromosomu 3p21 powszechnie usuwanych w raku płuca, co sugerowało, że mają one aktywność supresorową guza (25, 26, 34). Dalsze badania wykazały, że SEMA3B i SEMA3F transfekowane do pewnych linii komórek nowotworowych mogą hamować proliferację komórek nowotworowych w hodowli komórkowej i powstawanie nowotworów in vivo, chociaż nie zawsze konsekwentnie (27, 29). Jednak badania te nie zajmowały się rolą semaforin w inwazji guza, angiogenezie i przerzutach, ani nie odniosły się do mechanizmów leżących u podstaw tych działań hamujących. W naszych początkowych badaniach z czerniakiem, prostatą i komórkami nowotworu pęcherza stwierdziliśmy, że łagodne komórki nowotworowe eksprymują SEMA3F, podczas gdy wysoce przerzutowe komórki nowotworowe nie, co sugeruje odwrotną zależność między potencjałem przerzutowym a ekspresją SEMA3F. W celu bezpośredniego stwierdzenia, czy SEMA3F może wpływać na potencjał przerzutowy linii komórek nowotworowych, SEMA3F ulegał nadmiernej ekspresji w wysoce przerzutowej linii komórkowej ludzkiego czerniaka. Komórki SM wykorzystano z kilku powodów: (a) z dowolnej zbadanej linii komórkowej, komórki SM wyrażają najwyższe poziomy NRP2, funkcjonalnego receptora SEMA3F; (b) Komórki SM stanowią znakomity system modelowania ludzkiego guza u myszy nagich, ponieważ można je wstrzyknąć ortotopowo do skóry ze 100% udziałem guza, a objętość guza można zmierzyć zewnętrznie i (c) komórki SM dają przerzuty spontanicznie i powtarzalnie do węzły chłonne i płuca u myszy nagich. Duże przerzuty można zobaczyć wizualnie i nawet jeśli te czerniaki są amelanotyczne, rozsianione mikroprzerzuty można wykryć przez histologiczne barwienie swoistymi dla czerniaka przeciwciałami, takimi jak S100. lub HMB45 (35). Przeprowadzono dokładną analizę w poszukiwaniu przerzutów, w tym cięcia tkanek na wielu poziomach, barwienia standardowymi H & E, barwienia specyficznymi markerami czerniaka i hodowania kawałków mielonego płuc, aby zaobserwować jakikolwiek wzrost komórek czerniaka. Kontrole obejmowały nietransfekowane komórki SM i pozornie transfekowane komórki SM. Przerzuty zanalizowano po 6 tygodniach i żadnego nie wykryto w węzłach chłonnych i płucach u myszy noszących guzy wyrażające SEMA3F za pomocą dowolnej z tych metod. Aby rozwiązać kwestię możliwości rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych, ale były one zbyt małe do wykrycia, opracowano protokół poszukiwania okultystycznych mikroprzerzutów. Nawet po 12 tygodniach, żadna z 19 myszy, które otrzymały nowotwory eksprymujące SEMA3F w protokole 2, nie miała żadnych spontanicznych przerzutów, podczas gdy 17 z 18 myszy otrzymujących guzy kontrolne miało odległe przerzuty do płuc, jak określono za pomocą H & E, barwienia znacznika czerniaka, fluorescencji GFP i czerniaka odrastanie komórek. Gdy eksperymentalne przerzuty zostały przeprowadzone przez bezpośrednie wstrzyknięcie komórek do krążenia, eliminując potrzebę migracji komórek nowotworu i inwazji naczyń krwionośnych, komórki kontrolne łatwo przerzuciły się do płuc zgodnie z oczekiwaniami
[podobne: jak szybko obniżyć ciśnienie, kalafior wartości odżywcze, jarmuż właściwości ]