zol kraków prądnicka

Myszy RIP-NP 25-3 eksprymowały transgen zarówno w ich trzustce. komórki i ich grasica, ale nie w innych tkankach (29). Badanie przesiewowe przeprowadzono za pomocą PCR, jak opisano poprzednio (29). Myszy Kb (.) Uzyskano z B. Perarnau i FA Lemonnier (Departament SIDA-Retrovirus, Institut Pasteur, Paryż, Francja) (49). Myszy RIP-LCMV-NP x Kb (x) przeszukiwano pod kątem niedoboru H-2Kb za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem skoniugowanego z fikoerytryną anty-H-2Kb (BD Biosciences. Pharmingen). Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Alergii i Immunologii Zwierząt La Jolla. Wirusy. Klony 53M LCMV i LCMV-Arm-Var (33) trzykrotnie oczyszczono z łysinek na komórkach Vero i zapasy przygotowano przez pojedynczy pasaż na komórkach BHK-21. Myszom w wieku od 6 do 10 tygodni infekowano ip pojedynczą dawką 105 PFU (29). PV został dostarczony przez MJ Buchmeiera (The Scripps Research Institute, La Jolla, Kalifornia, USA) (50) i wstrzyknięto go w dawce 105 PFU na mysz. Wartości stężenia glukozy we krwi. Poziom glukozy we krwi był monitorowany co tydzień w systemie monitorowania stężenia glukozy we krwi OneTouch Ultra (LifeScan Inc.). Cukrzycę definiowano jako wartość stężenia glukozy we krwi wyższą niż 300 mg / dl (38). Immunohistochemia. Tkanki zanurzono w Tissue-Tek OCT (Bayer) i szybko zamrożono na suchym lodzie. Za pomocą szkiełek Superfrost Plus powleczonych kriomikrotomem i sialiną pocięto 6- do 10-.m skrawki tkanek. Skrawki następnie utrwalono za pomocą 90% etanolu w. 20 ° C i, po odcinkach przemywano w PBS, inkubowano z zestawem blokującym awidyna / biotyna (Vector Laboratories). Pierwotne i biotynylowane drugorzędowe przeciwciała (Vector Laboratories) inkubowano przez 60 minut każdy i reakcję barwną uzyskano przez sekwencyjną inkubację z koniugatem awidyna-peroksydaza (Vector Laboratories) i diaminobenzydyną a-nadtlenkiem wodoru. Jako pierwotne stosowane przeciwciała stosowano szczurze anty-mysie CD8a (Ly2; BD Biosciences. Pharmingen). Testy CTL. Aktywność lityczną CTL specyficznych wobec LCMV mierzono w standardowym 5-godzinnym oznaczeniu uwalniania 51Cr in vitro przy użyciu syngenicznych (MC57, H-2b) komórek docelowych zakażonych LCMV (MOI = 0,1). Wtórne testy CTL przeprowadzono po restymulacji splenocytów przez 5. 6 dni napromieniowanymi, syngenicznymi, zakażonymi LCMV komórkami wysięku otrzewnej (PEC) (51). Cytometrii przepływowej. W przypadku zabarwień wewnątrzkomórkowych zawiesiny pojedynczych komórek ponownie stymulowano przez 5 godzin za pomocą .g / ml ograniczonych do MHC klasy Iv peptydów wirusowych w obecności brefeldyny A. Komórki zabarwiono na powierzchniową ekspresję CD4 i CD8, utrwalono, permeabilizowano i wybarwiono dla wewnątrzkomórkowego IFN-y (przeciwciała otrzymano z BD Biosciences. Pharmingen). Próbki pobierano przy użyciu FACSCalibur (BD). Restymulacja in vitro. W przypadku odpowiedzi swoistych dla LCMV, splenocyty pamięci hodowano przez 6. 10 dni na zakażonych LCMV, napromieniowanych APC (makrofagi wysięku otrzewnowego z myszy H-2b). Po hodowli, żywotne komórki zebrano i komórki inkubowano przez 5 godzin z peptydem w obecności brefeldyny A przed barwieniem pod kątem wewnątrzkomórkowego IFN-a. (38). Analiza częstotliwości prekursorów. W celu analizy częstotliwości prekursorowej komórki śledziony zebrano w dniu 60 po pierwotnym zakażeniu LCMV. Komórki te seryjnie rozcieńczono i hodowano na 96-studzienkowych płaskodennych płytkach w obecności czynnika wzrostu komórek T i syngenicznych, napromieniowanych, zainfekowanych LCMV (103 PFU / ml) komórek śledziony (105 komórek / dołek). Po 5. 9 dniach każdą studzienkę badano pod kątem lizy CTL (opisanej powyżej) na komórkach docelowych, które pozostawiono niezakażonymi lub zakażono LCMV. Frakcję dodatnich hodowli (lizy> 11%) określono dla każdego rozcieńczenia (38). Plamy tetrameru in situ. W skrócie, świeżo zamrożone skrawki o grubości 6 .m wycięto z narządów będących przedmiotem zainteresowania i zabarwiono tetramerem MHC klasy I wyznakowanym fikoerytryną (1,0 .g / ml) z 2% normalnej surowicy koziej (NGS) i szczurzym anty-CD8. . (0,5 .g / ml)
[więcej w: kłykciny kończyste objawy, osp opalenica, inteligencja emocjonalna pdf ]